Nisin production by Lactococcus lactis subsp. lactis\' ATCC 11454 utilizing synthetic and natural media,skimm milk with or without extra suplementation\"

Nisina é extensamente utilizada como conservante natural em alimentos por conter características antimicrobianas contra germinação de esporos e bactérias Gram-positivas; potencialmente utilizada para produtos odontológicos e farmacêuticos, e como um agente terapêutico. Este estudo teve por objetivo melhorar a produção da nisina em diferentes meios de cultivo incluindo o leite desnatado. Com a expressão de nisina relacionada às condições de crescimento do Lactococcus lactis subsp. lactis ATCC 11454, a interferência dos componentes dos meios de cultivo, os parâmetros de crescimento e o tempo de incubação foram estudados para a obtenção desta bacteriocina. O cultivo do L. lactis foi realizado (36h/100rpm/30 oC) em caldo M17 e MRS em sua composição básica (pH = 6-7) e também suplementado com sacarose (1,0-12,5 g.L-1); fosfato de potássio (0,13 g.L- 1), asparagina (0,5 g.L-1) e sacarose (0,24 g.L-1); e diluído 1:1 com leite desnatado. O leite desnatado foi também utilizado como meio de cultivo mantendo sua composição básica (9–10 % sólidos totais, pH = 6,5). Alíquotas do cultivo em caldo (OD660 = 0,7; 3,20 mg DCW/L ou 102 CFU/mL) de cada grupo de ensaio foram transferidas para um novo meio de cultivo e incubado (36h/100rpm/30 oC). A produção de nisina foi detectada através da difusão em ágar utilizando Lactobacillus sake ATCC 15521 (30 0C/24h) como microrganismo sensível. A atividade detectada foi expressa em AU (arbitrary units – unidades arbitrárias), correspondendo aos halos de inibição de crescimento de L. sake. As unidades arbitrárias foram convertidas para concentração de nisina padrão (Nisaplinâ contêm 25 mg nisina / g produto, correspondem a 106 AU). A detecção da atividade da nisina foi menor do que 0,1 AU.mL-1 em caldo M17e MRS, aumentando significantemente para 142527,94 AU.mL-1 em M17 ou MRS diluído com leite desnatado (1:1). A atividade da nisina detectada foi altamente influenciada pela incorporação de leite desnatado em ambos o caldo, MRS e M17, com a máxima quantidade expressa em 36 horas de incubação. Os resultados mostram que o leite desnatado com meio de cultivo desenvolve ambiente propício e ideal para a produção de nisina, pois reduz os custos e aumenta a produção, por se tratar de um produto de fácil acesso e trivial.Nisin is a bacteriocin produced by Lactococcus lactis that inhibits the germination and growth of Gram-positive bacteria. As Nisin expression is related to the growth conditions of Lactococcus lactis subsp. lactis, the effects of growth parameters, media components and incubation time, were studied to optimize the expression of Nisin. L. lactis ATCC 11454 was grown (36h/100rpm/30oC) in both M17 and MRS basic broth media (pH = 6-7) supplemented with sucrose (1.0-12.5 g L-1); potassium phosphate (0.13 g L-1), asparagine (0.5 g L-1) and sucrose (0.24 g L-1); and diluted 1:1 with liquid non-fat milk. Liquid non-fat milk, undiluted, was also used as another basic medium (9–10 % total solids, pH = 6.5). Aliquots of cultured broth (OD660 = 0.7; 3.20 mg DCW/L or 102 CFU/ml) from each group were transferred into fresh broth and incubated further (36h/100/rpm30oC). Nisin production was assayed by agar diffusion using Lactobacillus sake ATCC 15521 (24h/300C) as the sensitive organism. Comparing diameters of growth inhibition of L. sake from wells of Nisin of known concentration (“standard Nisin”; Nisaplin, Sigma) to diameters of inhibition from defined volumes of L. lactis sp. lactis broth cultures, the amount of Nisin in broth cultures was measured as arbitrary units (AU ml-1) converted to Nisin mg/ml, with 25 mg of standard Nisin/g corresponding to 106 AU/g. The detection of Nisin activity was less than 0.1 AU.mL-1 in M17 or MRS broth, and increased to a maximum of 142527.94 AU.mL-1 in M17 or MRS diluted with liquid non-fat milk (1:1). The amount of Nisin expressed was strongly influenced by the incorporation of non-fat milk to both M17 and MRS broths (1:1), with the maximum amount expressed after 36 h of incubation. Nisin is widely used as a natural additive for preserving foods, pharmaceutical and dental products, and as a therapeutic agent. This study was performed to improve large scale Nisin production to meet the demand of its beneficial use in health-care products